Preguntas Frecuentes Relacionadas con Oligonucleótidos

¿En qué condiciones se entregan los oligos?
La Unidad de Síntesis y Secuenciación entrega los oligos resuspendidos en agua milli-Q estéril, condiciones que generan un pH cercano a 5.0. En caso de observar baja solubilidad (dependiente de algunas secuencias) se recomienda disolverlos en un buffer estéril a pH 7.0 (p.e. TE)

¿Cómo se deben almacenar los oligos?
Para almacenamiento prolongado, los oligos deben guardarse en forma liofilizada a -200C. Para experimentos numerosos, deben ser alicuotados y guardados a 40C. Los oligos NO deben congelarse y descongelarse repetidamente, ya que este proceso genera degradación física. El manejo también debe ser cuidadoso para evitar contaminación bacteriana.

¿De qué manera se cuantifican los oligos? (Ir a Cuantificación)
Los oligos se cuantifican por la medición de su absorción de UV a 260nm. Un oligo de cadena sencilla, disuelto en una solución acuosa neutra a una concentración de 33ug/ml tendrá una absorbancia a 260nm igual a 1.0. La unidad de densidad óptica (OD) se define como la absorbancia (a 260nm en una cuveta de 1cm de longitud) multiplicada por el volumen (en ml). Así, 1 OD es 33ug de DNA de cadena sencilla.

¿Qué datos se proporcionan en mi Reporte de Síntesis?
La USS proporciona un reporte escrito que incluye: secuencia del oligo, número de síntesis (importante para posteriores rastreos, longitud del oligo, rendimiento en OD’s, concentración en pmolas, concentración en ug, peso molecular, coeficiente de extinción molar y temperatura de fusión calculada por 2 métodos. En la parte posterior del reporte se imprime la secuencia que fue programada directamente en el sintetizador, la fecha de síntesis y las bases utilizadas.

¿Cuál es el rendimiento de la síntesis de oligos?
El rendimiento de la síntesis de oligos está afectado por muchos factores. La principal razón por la que se observan distintos rendimientos para el mismo oligo es que las columnas de síntesis no están cargadas con exactamente la misma cantidad de soporte (CPG), el material de inicio. Por ejemplo, una columna de 0.2 umol tendrá un mínimo de 0.2 umol del nucleósido 3′ para iniciar la síntesis, pero frecuentemente se tendrá mas de esta cantidad. Recuerde que esta es la cantidad de inicio y no el rendimiento final. El rendimiento final depende del tamaño del oligo, la eficiencia de acoplamiento y la composición nucleotídica.

¿Hasta que longitud es posible sintetizar un oligo?
En la USS es posible ensamblar oligos hasta de 80 nucleótidos utilizando una escala de 0.5 umol. De manera rutinaria se ensamblan oligos de 20-50nt con la escala de 0.2umol.

¿A qué se refieren con «Oligos Crudos»?
Los oligos crudos son aquellos que fueron desprotegidos con NH4OH concentrado, desalificados por extracción con n-butanol, secados a vacío y resuspendidos en agua o en algún buffer acuoso, manteniendo posibles productos de deleción. Todos los oligos producidos en la unidad se encuentran en su forma OH-terminal, esto es, no están fosfatados. La desalificación (ir a Desalificación), es especialmente importante para secuenciación por dideoxy, mutagnesis in vitro y quinación. Los oligos pueden purificarse por diversos métodos: electroforésis en gel de poliacrilamida (ir a Purificación), HPLC de intercambio iónico o fase reversa (en este caso es necesario solicitar los oligos en su modalidad Tr-ON) o bien por cartucho de fase reversa (también Tr-ON). Un oligo puro es aquel que ha sido separado de sus productos de deleción y grupos protectores remanentes. Se recomienda utilizar los oligos puros para cristalografía, marcaje, ensayos en geles de retardamiento y síntesis de genes.

¿Qué método de síntesis se utiliza en la USS?
Los oligonucletidos convencionales son sintetizados por el Método de Fosfitotriester, en la dirección 3′->5′. Particularmente, en la USS se utilizan sintetizadores automatizados de DNA modelo 391 de Applied Biosystems y ß-cianoetilfosforamiditos de Glen Research.

¿Por qué varían los valores de Tm? (Ir a Tm de Oligos)
La temperatura de fusión (Tm) de un oligo depende de varios factores: longitud, secuencia, contenido G+C, y el tipo y concentración de los cationes presentes, particularmente el ión Na+. Hasta el momento se han utilizado muchas fórmulas para ‘predecir’ este valor. En la USS se utilizan las siguientes fórmulas :

1. Tm = (2 * (A+T)) + (4 * (C+G))
2. Tm = 67.5 + 0.34*(%(C+G)) – 395/longitud

La primera se recomienda para oligos menores de 20 bases y la segunda para oligos que varían de 20 a 100 bases. Una tercera ecuación incluye factores como concentración de formamida (F) y de cationes monovalentes (M), es:
Tm = 81.5 + 16.6 log M + 41(%(C+G)) – 500/longitud – 0.6*F
y es recomendable para oligos mayores de 50 bases en pH’s de 5 a 9.

¿Cómo se determina la temperatura de «annealing» para una PCR?
Calcule la Tm con la fórmula ‘que mas le guste’ y reste de 5 a 10°C. Si los dos oligos tienen distintas temperaturas de fusión, NO promedie los valores, use el menor de ellos para que los dos oligos puedan hibridar.

¿Qué modificaciones se pueden realizar? (Ir a Oligos Modificados).
En la unidad de sntesis es posible producir oligofosforotioatos, marcar la terminal 5′ con fluorescíena o la terminal 3′ con colesterol. Pero pueden realizarce una gran gama de marcajes a petición expresa del usuario.

¿Cuánto cuesta un oligo?
El precio de un oligo depende del número de bases que lo constituyan. En la USS se ofertan a $0.80 USDls por base sin ningún otro cargo extra. Así, un oligo de 20 bases de longitud tendrá un costo de : 20 x 0.80 = $16.00 US Dls.