Síntesis Química de Oligonucleótidos
Durante los últimos 40 años, cuatro métodos para sintetizar ADN se han desarrollado. Estos métodos son :
- Fosfato-Diéster,
- Fosfato-Triéster,
- Fosfito-Triéster y
- H-fosfonato.
diferenciándose básicamente por la forma en la que se generan los enlaces internucleotídicos.
En la Unidad de Síntesis, se utiliza el Método del Fosfito-Triéster en Fase Sólida, en el que la cadena creciente de ADN se mantiene «anclada» a un soporte sólido (CPG) depositado en una columna delimitada por dos filtros e insoluble en los reactivos que fluyen a través de la misma.
La síntesis de un oligo se completa mediante un ciclo de reacciones que se repiten hasta que se alcanza la longitud deseada del oligo. Este ciclo consta de cuatro reacciones principales:
- Desprotección
Consiste en eliminar mediante un tratamiento ligeramente ácido, al grupo Dimetoxitritilo (DMT). Este grupo protege al Hidroxilo 5′ terminal de la base (nucleótido) correspondiente. - Acoplamiento
Una vez libre el grupo hidroxilo, se adiciona el siguiente nucleótido, en forma de ß-cianoetilfosforamidito, correspondiente a la sequencia deseada. - Bloqueo (capping)
Concluído el paso de acoplamiento, se bloquean todos los hidroxilos que no reaccionaron (menor al 2% del total) con la nueva base, esto mediante una reacción de acetilación. - Oxidación
Finalmente, el grupo fosfito internucleotídico se oxida a un grupo fosfato estable.
El ciclo de reacciones se repite tantas veces como nucleótidos se deseen adicionar.
Al terminar con el total de bases a unir, se ‘libera’ del soporte la cadena de ADN recién sintetizada mediante un tratamiento ligeramente básico (hidróxido de amonio a 55 grados durante 12 hrs).
Posteriormente se extrae de esa solución amoniacal con n-Butanol, se seca a vacío en Savant, se resuspende en agua mQ esterilizada y se analiza por electroforesis en gel de poliacrilamida. Se cuantifica por absorción de luz UV a 260nm y se entrega a la persona solicitante.